因業(yè)務調整，部分個人測試暫不接受委托，望見諒。

微生物多樣性研究的核心工具：16S/18S/ITS擴增子測序技術解析

簡介

微生物在自然界中廣泛存在，其種類和功能的多樣性對生態(tài)系統(tǒng)平衡、人類健康及工業(yè)生產具有深遠影響。然而，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法僅能檢測約1%的微生物類群，限制了研究的深度。隨著高通量測序技術的發(fā)展，基于16S rRNA、18S rRNA及ITS（Internal Transcribed Spacer）區(qū)域的擴增子測序技術應運而生，成為解析微生物群落組成與功能的核心手段。該技術通過靶向擴增特定基因區(qū)域，結合高通量測序與生物信息學分析，能夠快速、準確地揭示樣本中細菌、古菌（16S）、真核微生物（18S）及真菌（ITS）的多樣性特征，為環(huán)境監(jiān)測、疾病診斷、農業(yè)優(yōu)化等領域提供關鍵數(shù)據(jù)支持。

檢測項目及簡介

1. 16S rRNA基因測序 細菌和古菌的16S rRNA基因包含9個可變區(qū)（V1-V9）和保守區(qū)，可變區(qū)的序列差異可用于物種分類。通過設計引物擴增V3-V4或V4-V5等高變區(qū)，結合Illumina NovaSeq等測序平臺，可實現(xiàn)屬甚至種水平的微生物鑒定。例如，V4區(qū)擴增（引物515F-806R）廣泛應用于腸道菌群研究。

2. 18S rRNA基因測序 針對真核生物（如原生動物、藻類、微型后生動物）的18S rRNA基因，其V4或V9區(qū)常被選作擴增靶點。例如，V4區(qū)（引物TAReuk454FWD/TAReukREV3）適用于水生生態(tài)系統(tǒng)中浮游生物群落的分析，揭示水體富營養(yǎng)化與微生物演替的關系。

3. ITS區(qū)域測序 真菌的ITS區(qū)域位于18S、5.8S和28S rRNA基因之間，包含ITS1和ITS2兩個高變區(qū)。ITS1（引物ITS5-ITS2）常用于環(huán)境樣本中真菌多樣性的檢測，而ITS2（引物ITS3-ITS4）因更短的擴增長度（200-400 bp）適配二代測序平臺，廣泛應用于土壤和植物共生真菌研究。

檢測的適用范圍

該技術主要適用于以下場景：

• 環(huán)境科學：分析土壤、水體、空氣等環(huán)境樣本的微生物群落結構，評估污染修復效果或生態(tài)恢復進程。
• 醫(yī)學研究：解析腸道、口腔、皮膚等人體微生態(tài)與疾?。ㄈ缪装Y性腸病、肥胖癥）的關聯(lián)，指導個性化診療。
• 農業(yè)與食品：監(jiān)測發(fā)酵食品（如酸奶、泡菜）中的功能菌群，優(yōu)化生產工藝；評估益生菌制劑對作物根際微生物的影響。
• 工業(yè)生物技術：篩選污水處理系統(tǒng)中的功能微生物，提升污染物降解效率。

檢測參考標準

為確保數(shù)據(jù)可靠性和可比性，擴增子測序需遵循以下標準：

1. ISO 17776:2016 Microbiology of the food chain — Guidance on the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations，規(guī)范測序數(shù)據(jù)質量控制流程。
2. MIxS標準（Minimum Information about any (x) Sequence） 由基因組標準聯(lián)盟（GSC）制定，要求實驗元數(shù)據(jù)（如采樣地點、DNA提取方法）的完整記錄（參照標準號：GB/T 37850-2019）。
3. SOP-QM-001（中國微生物組計劃） 《環(huán)境樣本微生物擴增子測序技術規(guī)范》，涵蓋實驗設計、引物選擇至數(shù)據(jù)分析的全流程標準化操作。

檢測方法及儀器

1. 實驗流程

   • DNA提取：使用PowerSoil DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories）或FastDNA SPIN Kit（MP Biomedicals）獲取高質量基因組DNA。
   • PCR擴增：采用高保真酶（如KAPA HiFi HotStart ReadyMix）擴增目標區(qū)域，引物需添加Illumina測序接頭與樣本特異性標簽（Barcode）。
   • 文庫構建與測序：通過Agilent 2100 Bioanalyzer檢測片段大小，使用Illumina NovaSeq 6000平臺進行雙端測序（PE250）。

2. 數(shù)據(jù)分析

   • 原始數(shù)據(jù)處理：使用Cutadapt去除引物序列，DADA2或QIIME 2進行質量控制與去噪。
   • 物種注釋：基于SILVA（16S/18S）或UNITE（ITS）數(shù)據(jù)庫進行OTU/ASV聚類與分類學注釋。
   • 統(tǒng)計分析：利用R語言vegan包計算Alpha多樣性（Shannon指數(shù)）和Beta多樣性（PCoA分析），揭示群落差異。

3. 關鍵儀器

   • PCR儀：Bio-Rad T100 Thermal Cycler
   • 電泳系統(tǒng)：Agilent 4200 TapeStation
   • 高通量測序儀：Illumina NovaSeq 6000
   • 生物信息分析平臺：IBM Power Systems AC922（支持AI驅動的物種預測模型）

總結

16S/18S/ITS擴增子測序技術以其高靈敏度、高通量的優(yōu)勢，已成為微生物組研究的基石。從實驗設計到數(shù)據(jù)分析的全流程標準化，結合不斷更新的數(shù)據(jù)庫（如GTDB代替?zhèn)鹘y(tǒng)Greengenes），進一步提升了物種注釋的準確性。未來，隨著三代測序（PacBio SMRT）和單細胞技術的融合，該技術將在解析低豐度微生物及菌株水平變異中發(fā)揮更大潛力，為精準醫(yī)學和生態(tài)工程提供更強大的工具支持。